HRF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402606-ACT

Humanes TPT1 kodiert den Histamin-freisetzenden Faktor (HRF), ein konserviertes multifunktionales Protein, das an Zellwachstum, Überleben und Stressadaptation beteiligt ist. HRF wirkt an Prozessen mit, die mit translationaler Kontrolle, Mikrotubuli-Dynamik und der Regulation der Apoptose verknüpft sind, und kann über histaminassoziierte Signalwege die Immun-Signalgebung sowie entzündliche Reaktionen beeinflussen. Eine dysregulierte TPT1/HRF-Expression wurde in verschiedenen Krankheitskontexten beschrieben, darunter Krebsbiologie, allergische Entzündung und andere immunvermittelte Erkrankungen, in denen sie Proliferation, Zytokinnetzwerke und zelluläre Widerstandsfähigkeit modulieren kann. Diese Eigenschaften machen TPT1 zu einem nützlichen Ziel, um Signalwege zu untersuchen, die Proteostase und Stressantworten mit immun- und tumorassoziierten Phänotypen koppeln.

HRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HRF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HRF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HRF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HRF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.