hnRNP A2/B1 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h2): sc-400635-KO-2

Übersicht

HNRNPA2B1 kodiert das menschliche heterogene nukleäre Ribonukleoprotein hnRNP A2/B1, einen RNA-bindenden Faktor, der durch Interaktionen mit Komponenten des Spliceosoms und der Transportmaschinerie das Spleißen von Prä‑mRNA, die Stabilität von mRNA, den nukleären Export und die Translation koordiniert. hnRNP A2/B1 fungiert zudem als m6A-„Reader“, der RNA-Methylierung mit der Prozessierung von Transkripten und der alternativen Exonnutzung verknüpft und so Genexpressionsprogramme während Proliferation und Differenzierung mitgestaltet. Eine dysregulierte HNRNPA2B1-Aktivität wird mit abweichendem RNA-Stoffwechsel, der Dynamik von Stressgranula und veränderten Signaloutputs in Verbindung gebracht, die häufig in der Krebsbiologie sowie in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen untersucht werden. Durch seine zentrale Rolle in der posttranskriptionellen Regulation eignet es sich als wichtiger Knotenpunkt, um Signalwege zu analysieren, die die Wahl von Transkript-Isoformen, die RNA-Lokalisierung und die Umgestaltung des Proteoms steuern.

hnRNP A2/B1 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h2) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des HNRNPA2B1-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des HNRNPA2B1-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.

Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.

Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter

Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das hnRNP A2/B1 HDR-Plasmid (h2) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte HNRNPA2B1 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem hnRNP A2/B1 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h2):

• Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das HNRNPA2B1 offene Lesegerüst.
  Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
  Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
  Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.

Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem

Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des HNRNPA2B1-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:

• Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
  Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
  Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen

Hauptmerkmale

• gRNA, die auf HNRNPA2B1 Exon(e) abzielt, die für die hnRNP A2/B1 Funktion entscheidend sind
  Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
  HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
  loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
  Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.