Herc2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405015-ACT

HERC2 kodiert die menschliche E3-Ubiquitin-Protein-Ligase Herc2, eine große Ubiquitin-Ligase mit HECT-Domäne, die die ubiquitinabhängige Proteostase und Signalübertragung koordiniert. Herc2 ist an Netzwerken der DNA-Schadensantwort und an chromatinassoziierten Prozessen beteiligt und hilft dabei, den Proteinumsatz sowie die Lokalisation zentraler Regulatoren zu modulieren, die für Genomstabilität, Zellzyklusprogression und Stresssignalwege wichtig sind. Über Ubiquitinierung und gerüstartige (Scaffold-)Funktionen beeinflusst HERC2 Signalwege, die mit Replikationsstress und Reparatur verknüpft sind; eine veränderte HERC2-Aktivität wurde mit erblichen neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und mit für Krebs relevanten Defekten der Genominstandhaltung in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen HERC2 zu einem nützlichen Ziel, um die Regulation des Ubiquitinwegs, das Zusammenspiel von DNA-Reparaturwegen und Genotyp‑Phänotyp‑Beziehungen in menschlichen Zellmodellen zu untersuchen.

Herc2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HERC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Herc2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HERC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HERC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Herc2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HERC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Herc2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Herc2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HERC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.