Plasmide CRISPR d'Activation (m) HECTD1: sc-431500-ACT

Le gène murin **Hectd1** code **HECTD1**, une ligase E3 de l’ubiquitine de type HECT qui catalyse le transfert d’ubiquitine vers des protéines cibles afin de contrôler leur stabilité, leur localisation et leur activité de signalisation. HECTD1 a été associée à la régulation de la protéostasie, de l’organisation du cytosquelette et de la migration cellulaire via un remodelage ubiquitine‑dépendant de complexes protéiques, influençant des voies du développement et de réponse au stress. Dans des modèles murins, une altération de la fonction de **Hectd1** a été liée à la mise en place des patrons embryonnaires et au développement du tube neural, soulignant sa pertinence pour les mécanismes à l’origine de malformations congénitales. En tant que composant de la voie de l’ubiquitine, HECTD1 est également étudiée dans des contextes où une ubiquitination dérégulée contribue à une signalisation aberrante et à l’homéostasie tissulaire.

HECTD1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hectd1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HECTD1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hectd1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hectd1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HECTD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hectd1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HECTD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HECTD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Hectd1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.