HAX-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402087-ACT

HAX1 kodiert HAX‑1, ein überwiegend an Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum assoziiertes Protein, das Apoptose, die Calciumhomöostase und die Zytoskelettdynamik reguliert. Es ist an Stressantwort- und Überlebenssignalen beteiligt, indem es die Integrität der mitochondrialen Membran moduliert und mit Prozessen der BCL‑2‑Familie interagiert; dadurch beeinflusst es die Caspase-Aktivierung sowie das Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies. HAX‑1 trägt außerdem zum Aktin-Remodeling und zum intrazellulären Transport bei und ist damit mit Programmen der Zellmigration und -adhäsion verknüpft. Eine dysregulierte HAX1-Expression oder -Funktion wurde mit verändertem Überleben hämatopoetischer Zellen, der Homöostase von Immunzellen und der Tumorbiologie in Verbindung gebracht, was es zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung von Überlebenssignalwegen und Zellschicksalsentscheidungen macht.

HAX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HAX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HAX-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HAX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HAX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HAX-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HAX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HAX-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HAX-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HAX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.