Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α 12}: sc-401264-ACT

GNA12 code la sous-unité alpha Gα12 des protéines G hétérotrimériques, un transducteur clé des signaux des RCPG (GPCR) couplés aux voies de la classe G12/13. Après activation, Gα12 recrute des facteurs d’échange de nucléotides guanyliques (GEF) de Rho afin de stimuler la signalisation de RhoA, modulant la dynamique du cytosquelette d’actine, l’adhérence cellulaire, la migration et la contractilité. Cet axe de signalisation interagit avec la voie MAPK et d’autres réseaux sensibles au stress, influençant des programmes transcriptionnels liés à la croissance et aux signaux inflammatoires. Une activité dérégulée de GNA12/Gα12 a été associée à une motilité anormale et à des phénotypes invasifs dans de multiples contextes cancéreux, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques des voies de signalisation associées aux métastases.

Gα 12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNA12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα 12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNA12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNA12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα 12. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNA12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα 12 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα 12 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNA12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.