GRPR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401637-ACT

Human GRPR kodiert den Gastrin-Releasing-Peptide-Rezeptor, einen Sieben-Transmembran-GPCR, der Gastrin-Releasing Peptide und verwandte bombesinähnliche Liganden bindet, um die neuroendokrine Signalübertragung zu regulieren. Die Aktivierung von GRPR rekrutiert heterotrimere G-Proteine und stimuliert den PLCβ-abhängigen Phosphoinositid-Umsatz, die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+ sowie nachgeschaltete MAPK/ERK- und PKC-Signalwege, was Proliferation, Sekretion und die Kontraktilität glatter Muskulatur beeinflusst. Der Rezeptor ist breit relevant für Studien zur sensorischen Verarbeitung und zur gastrointestinalen Physiologie, und eine veränderte GRPR-Signalgebung wurde in mehreren Modellsystemen mit onkogenen und neuroverhaltensbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht. GRPR-Expression und Aktivität des Signalwegs werden häufig genutzt, um GPCR-gesteuerte Transkriptionsprogramme, Calciumdynamik und ligandenabhängige Signalisierungs-Biases in humanen Zellen zu untersuchen.

GRPR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GRPR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRPR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GRPR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GRPR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRPR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GRPR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRPR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRPR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GRPR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.