Plasmide CRISPR d'Activation (m2) GRIF-1: sc-427813-ACT-2

Chez la souris, Trak2 code pour GRIF-1, un adaptateur de trafic intracellulaire qui couple des cargaisons aux moteurs de kinésine afin d’assurer le transport à longue distance, dépendant des microtubules, d’organites et de vésicules, avec des rôles particulièrement importants dans les compartiments neuronaux et synaptiques. GRIF-1 contribue au positionnement des mitochondries et d’autres cargaisons le long des axones et des dendrites, influençant la répartition de l’énergie, l’homéostasie du calcium et la signalisation dépendante de l’activité au sein de voies qui régulent le maintien des neurites et la fonction synaptique. La perturbation du transport médié par TRAK2 est associée à des phénotypes cellulaires pertinents pour la neurodégénérescence et les troubles du neurodéveloppement, dans lesquels une dynamique organellaire et un trafic axonal altérés augmentent la vulnérabilité neuronale. Les outils de recherche Trak2/GRIF-1 permettent des études mécanistiques du transport intracellulaire, de la motilité mitochondriale et du trafic de cargaisons spécifiques des neurones, notamment via l’exploration de voies dans des modèles génétiques et des tests sur cellules.

GRIF-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Trak2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRIF-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Trak2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Trak2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRIF-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Trak2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRIF-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRIF-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Trak2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.