gremlin-2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423886-ACT

Das murine Grem2-Gen kodiert Gremlin-2, ein sekretiertes Cystin-Knoten-Protein, das als extrazellulärer Antagonist von BMP-Liganden wirkt und so Signalgradienten der BMP/TGF-β-Superfamilie sowie nachgeschaltete, SMAD-abhängige Transkriptionsprogramme formt. Durch die Modulation BMP-gesteuerter Differenzierungssignale trägt Gremlin-2 zur Regulation von Gewebemusterung, Organogenese und stromal-epithelialem Crosstalk bei, mit nachfolgenden Effekten auf Umbauprozesse der extrazellulären Matrix und zelluläre Schicksalsentscheidungen. Eine fehlregulierte Grem2-Expression bzw. BMP-Antagonisierung wurde in der Literatur mit aberranten Entwicklungsprozessen und veränderten homöostatischen Signalwegen in Zusammenhängen wie muskuloskelettalen, reproduktiven und fibroseähnlichen Phänotypen in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen Grem2 zu einem nützlichen Ziel, um BMP-Signalweg-Feedback, Linienfestlegung (Lineage Specification) und Kompensation in Signalnetzwerken in Maus-Zell- und Organoidmodellen zu untersuchen.

gremlin-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Grem2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

gremlin-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Grem2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Grem2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen gremlin-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Grem2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von gremlin-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des gremlin-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Grem2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.