granulysin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403208-ACT

Das humane GNLY-Gen kodiert Granulysin, ein zytolytisches und proinflammatorisches Effektorprotein, das in zytotoxischen Granula von NK-Zellen und aktivierten CD8+-T-Zellen gespeichert ist. Nach der Bildung einer immunologischen Synapse wird Granulysin freigesetzt, um antimikrobielle Aktivität zu fördern und in Zusammenarbeit mit Perforin und Granzymen zur Abtötung von Zielzellen beizutragen; dadurch werden angeborene und adaptive Immunantworten geprägt. Die GNLY-Expression ist mit Programmen der Lymphozytenaktivierung und zytotoxischen Differenzierungszuständen verknüpft, und ihre Fehlregulation wird im Kontext von Immunstörungen, chronischen Infektionen, der Tumor-Immunüberwachung und Mechanismen entzündlicher Erkrankungen untersucht. Als Ausleseparameter der Biologie zytotoxischer Lymphozyten wird GNLY in der Immunologie sowie in der Forschung zu Wirt–Pathogen-Interaktionen häufig als Marker und funktioneller Mediator genutzt.

granulysin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GNLY-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

granulysin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GNLY-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GNLY-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen granulysin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GNLY-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von granulysin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des granulysin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GNLY-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.