Plásmido CRISPR de Activación (h) GRAF: sc-403652-ACT

ARHGAP26 codifica GRAF, una proteína activadora de la actividad GTPasa de Rho que reduce la señalización de la familia Rho para coordinar la remodelación del citoesqueleto de actina, el tráfico de membranas y la dinámica de las adhesiones focales. Mediante interacciones con reguladores endocíticos y del citoesqueleto, GRAF contribuye al control de la morfología celular, la migración y la internalización de receptores, vinculando vías dependientes de RhoA con la dinámica vesicular. La actividad desregulada de ARHGAP26 se ha asociado con programas alterados de motilidad y adhesión celular y se ha investigado en el contexto de la señalización oncogénica y de mecanismos de enfermedades hematológicas que implican una regulación aberrante de las GTPasas Rho.

GRAF El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ARHGAP26 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GRAF El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ARHGAP26 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ARHGAP26, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GRAF. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ARHGAP26 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GRAF en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GRAF en células tumorales con expresión de ARHGAP26 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.