GPR4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403659-ACT

Das humane GPR4-Gen kodiert einen protonensensitiven G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der als extrazellulärer pH-Sensor fungiert und saure Mikroumgebungen mit intrazellulärer Signalübertragung verknüpft. Nach Aktivierung koppelt GPR4 an heterotrimere G-Proteine und moduliert Second-Messenger-Signalwege, darunter cAMP/PKA sowie RhoA-abhängige zytoskelettale und transkriptionelle Programme, wodurch das Verhalten von Endothel- und Immunzellen beeinflusst wird. Dieser Rezeptor trägt zur Regulation der vaskulären Homöostase, der Barrierefunktion und entzündlicher Signalwege in Situationen bei, in denen Gewebeazidose auftritt. Eine veränderte GPR4-Aktivität wurde mit krankheitsrelevanten Prozessen wie vaskulärer Entzündung und Stressantworten der Mikroumgebung in Modellen für Krebs sowie kardiometabolische Erkrankungen in Verbindung gebracht und stellt damit ein nützliches Ziel für mechanistische Studien dar.

GPR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPR4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPR4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPR4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPR4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPR4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.