Plasmide CRISPR d'Activation (h2) GPR34: sc-405989-ACT-2

Le gène humain GPR34 code un récepteur couplé aux protéines G de type rhodopsine, principalement associé à une signalisation via Gi/o, modulant la dynamique de l’AMPc intracellulaire et les réponses MAPK/ERK en aval dans des contextes impliquant des cellules immunitaires et gliales. La réactivité rapportée à des ligands de type lysophospholipides et à des médiateurs apparentés inscrit GPR34 dans des réseaux de GPCR senseurs de lipides qui influencent la chimiotaxie, la signalisation associée aux cytokines et les programmes d’activation microgliale. Des altérations de l’expression de GPR34 ainsi que des modifications récurrentes, régulatrices ou codantes, ont été associées à une dysrégulation immunitaire et à la biologie des hémopathies malignes, ce qui appuie son utilisation comme point d’entrée moléculaire pour interroger des états transcriptionnels pilotés par les GPCR. L’édition du gène ou la perturbation de GPR34 permet des études mécanistiques du trafic du récepteur, du biais de signalisation dépendant du ligand et de phénotypes spécifiques de type cellulaire dans des modèles de neuroinflammation et de communication au sein du microenvironnement tumoral.

GPR34 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPR34 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR34 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPR34 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPR34, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR34. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPR34 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR34 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR34 dans les cellules tumorales présentant une expression de GPR34 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.