GLDC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403511-ACT

Das humane GLDC-Gen kodiert die Glycin-Decarboxylase, die P-Protein-Komponente des mitochondrialen Glycin-Spaltungssystems, das die Decarboxylierung von Glycin katalysiert und die Übertragung von C1-Einheiten auf Tetrahydrofolat unterstützt. Über diese Aktivität verknüpft GLDC den Abbau von Aminosäuren mit dem folatabhängigen Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel und beeinflusst dadurch die Nukleotidbiosynthese, das Redoxgleichgewicht und den mitochondrialen Kohlenstofffluss. Eine Störung der GLDC-Funktion beeinträchtigt die Glycin-Homöostase und Ein-Kohlenstoff-Stoffwechselwege; zudem ist GLDC an angeborenen Störungen des Glycinstoffwechsels sowie an breiteren Kontexten metabolischer Dysregulation beteiligt. Als mitochondriales Enzym mit zentraler Bedeutung für die Glycinverwertung wird GLDC häufig im Hinblick auf seine Rolle in der zellulären metabolischen Anpassung und der Regulation der Biosynthesekapazität untersucht.

GLDC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GLDC-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GLDC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GLDC-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GLDC-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GLDC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GLDC-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GLDC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GLDC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GLDC-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.