GLCNE Plásmido CRISPR/Cas9 KO (m): sc-424509

Descripción general

Gne codifica la glucosamina (UDP‑N‑acetil)-2‑epimerasa/N‑acetilmanosamina quinasa (GLCNE), una enzima bifuncional que cataliza los primeros pasos comprometidos de la biosíntesis de ácido siálico a partir de UDP‑GlcNAc, pasando por ManNAc y ManNAc‑6‑fosfato. Al regular la disponibilidad celular de CMP‑ácido siálico, GLCNE influye en la sialilación de proteínas y lípidos, afectando la maduración de glicoproteínas, el tráfico de membranas, la señalización de receptores y las interacciones célula–célula. Un flujo alterado a través de esta vía perturba procesos dependientes de la glicosilación, incluida la homeostasis de células musculares y renales, y la disfunción de GNE se asocia con fenotipos de enfermedades neuromusculares y con trastornos más amplios de la glicosilación. En sistemas murinos, Gne constituye un nodo manejable para investigar cómo la sialilación controla programas del desarrollo, respuestas al estrés y redes de señalización mediadas por glicanos.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO GLCNE (m) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen Gne en líneas celulares mouse. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus Gne, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR GLCNE (m) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido Gne.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido GLCNE CRISPR/Cas9 KO (m):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto Gne.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus Gne y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones Gne críticos para la función GLCNE
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.