Plasmide CRISPR d'Activation (h) GlcNAc kinase: sc-407809-ACT

NAGK code la kinase humaine de la GlcNAc, une enzyme cytosolique qui phosphoryle la N‑acétylglucosamine en GlcNAc‑6‑phosphate, reliant ainsi la voie de récupération (salvage) de la GlcNAc au métabolisme des hexosamines. Cette activité contribue à la production d’UDP‑GlcNAc, un substrat donneur central pour la glycosylation N‑ et O‑liée et d’autres processus dépendants des glycannes qui régulent le repliement des protéines, leur trafic intracellulaire et la transduction du signal. En influençant la capacité de glycosylation, NAGK peut moduler les réponses cellulaires à la disponibilité en nutriments et au stress, avec des effets en aval sur la croissance cellulaire et les programmes de différenciation. Un flux d’hexosamines et une glycosylation dérégulés sont des caractéristiques récurrentes dans des contextes de maladies métaboliques et prolifératives, ce qui fait de NAGK un nœud utile pour l’interrogation mécanistique des voies biologiques.

GlcNAc kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NAGK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GlcNAc kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NAGK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NAGK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GlcNAc kinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NAGK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GlcNAc kinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GlcNAc kinase dans les cellules tumorales présentant une expression de NAGK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.