GAPDH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400163-ACT

GAPDHS umano codifica un’isoforma di gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi specifica degli spermatozoi (famiglia GAPDH) che catalizza una fase chiave della glicolisi, convertendo la gliceraldeide-3-fosfato in 1,3-bisfosfoglicerato con concomitante produzione di NADH. GAPDHS è altamente espresso nelle cellule germinali maschili e sostiene il metabolismo energetico necessario per la maturazione e la motilità degli spermatozoi, collegandosi al flusso glicolitico, all’equilibrio redox e alla generazione di ATP nel flagello. La deregolazione o la variabilità genetica di GAPDHS è stata associata a una funzionalità spermatica compromessa e a fenotipi legati all’infertilità, rendendolo rilevante per studi di biologia riproduttiva, compartimentalizzazione metabolica e coordinamento tra mitocondri e glicolisi. In quanto enzima della famiglia GAPDH, costituisce inoltre un nodo utile per indagare come gli enzimi glicolitici contribuiscano a programmi cellulari specializzati oltre al metabolismo “housekeeping”.

GAPDH-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GAPDHS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GAPDH-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GAPDHS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GAPDHS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GAPDH-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GAPDHS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GAPDH-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GAPDH-2 nelle cellule tumorali con espressione di GAPDHS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.