GalNAc-T3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407682-ACT

GALNT3 kodiert die Polypeptid‑N‑Acetylgalactosaminyltransferase 3 (GalNAc‑T3), ein im Golgi-Apparat lokalisiertes Initiationsenzym der mucinartigen O‑Glykosylierung, das GalNAc auf Serin-/Threoninreste sekretorischer und membranständiger Proteine überträgt. Indem GalNAc‑T3 die Initiationsstellen von O‑Glykanen festlegt, beeinflusst es die Proteinfaltung, den intrazellulären Transport, die Proteaseempfindlichkeit sowie die Funktion von Rezeptoren und Adhäsionsmolekülen in epithelialen und sekretorischen Signalwegen. Eine veränderte GALNT3‑Aktivität wurde mit einer fehlregulierten Glykoproteinverarbeitung und extrazellulären Signalübertragung in Verbindung gebracht, was für Störungen der Phosphathomöostase und allgemeinere, mit Glykosylierung assoziierte Phänotypen relevant ist. Die Modulation von GalNAc‑T3 ist daher nützlich, um zu untersuchen, wie O‑Glykosylierung Zell‑Zell‑Interaktionen, sekretorische Programme und die Ligand‑Rezeptor‑Kommunikation steuert.

GalNAc-T3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GALNT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GalNAc-T3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GALNT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GALNT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GalNAc-T3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GALNT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GalNAc-T3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GalNAc-T3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GALNT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.