GALE CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408127-ACT

Die humane GALE (UDP-Galactose-4-Epimerase) katalysiert die reversible Umwandlung von UDP-Galactose in UDP-Glucose sowie von UDP‑N‑Acetylgalactosamin in UDP‑N‑Acetylglucosamin und verknüpft damit den Leloir-Weg mit dem breiteren Nukleotidzucker-Stoffwechsel. Durch diese Aktivitäten trägt GALE zur Aufrechterhaltung der Kohlenhydrat-Homöostase bei und stellt aktivierte Zucker bereit, die für Glykosylierungsprozesse benötigt werden und Protein-Faltung, -Transport (Trafficking) sowie Zell‑Zell‑Signalübertragung prägen. Eine Störung des GALE-abhängigen Stoffflusses kann die Glykan-Zusammensetzung verändern und ER- und Golgi-assoziierte biosynthetische Programme beeinflussen. Eine Fehlfunktion von GALE ist mit der Epimerase‑Mangel‑Galaktosämie assoziiert und ist relevant für Studien zu metabolischen Stressantworten und glykosylierungsbezogenen Phänotypen.

GALE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GALE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GALE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GALE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GALE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GALE-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GALE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GALE-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GALE-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GALE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.