GABARAPL1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403288-ACT

GABARAPL1 (GABA-Rezeptor-assoziiertes Protein-ähnlich 1) ist ein ubiquitinähnlicher Modifikator der ATG8-Familie, der an Phosphatidylethanolamin konjugiert und so die Bildung von Autophagosomen, die Rekrutierung von Fracht (Cargo) sowie die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen unterstützt. Es ist an Programmen der selektiven Autophagie beteiligt, darunter Mitophagie und Aggrephagie, und trägt über Interaktionen mit Adaptorproteinen, die ein LIR-Motiv enthalten, zum intrazellulären Transport und zur Homöostase von Organellen bei. Indem GABARAPL1 die Proteostase und Stressantworten mitprägt, beeinflusst es Signalnetzwerke, die mit Nährstoffsensorik und zellulärer Qualitätskontrolle verknüpft sind, einschließlich Signalwegen, die mit mTOR und der lysosomalen Funktion koordiniert werden. Eine veränderte GABARAPL1-Expression oder ein veränderter autophagischer Flux wurde mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, das Überleben von Krebszellen und kardiometabolischen Stress relevant sind, was GABARAPL1 für mechanistische Studien krankheitsassoziierter Proteostase nützlich macht.

GABARAPL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GABARAPL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GABARAPL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GABARAPL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GABARAPL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GABARAPL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GABARAPL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GABARAPL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GABARAPL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GABARAPL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.