Plasmide CRISPR d'Activation (h) Fucokinase: sc-409449-ACT

Le gène humain **FUK** code la fucokinase, une kinase cytosolique qui phosphoryle la **L‑fucose** en **fucose‑1‑phosphate**, initiant la voie de sauvetage de la L‑fucose qui reconstitue le **GDP‑fucose** nécessaire aux réactions de fucosylation. En contribuant à l’homéostasie des sucres nucléotidiques, la fucokinase participe aux processus de glycosylation liés à l’appareil de Golgi et au réticulum endoplasmique, lesquels régulent le repliement des protéines, la signalisation des récepteurs et les interactions cellule‑cellule. Des altérations du métabolisme de la fucose et une fucosylation dérégulée ont été associées à des changements de la modulation immunitaire, de l’inflammation et des signatures glycanes liées aux tumeurs, faisant de **FUK** un point d’entrée pertinent pour étudier le contrôle glycométabolique des phénotypes cellulaires. La modulation expérimentale de l’expression de **FUK** peut aider à déterminer comment le GDP‑fucose issu de la voie de sauvetage influence le remodelage des glycoprotéines et des glycolipides dans des contextes de stress et de différenciation.

Fucokinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FUK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Fucokinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FUK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FUK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Fucokinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FUK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Fucokinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Fucokinase dans les cellules tumorales présentant une expression de FUK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.