FRYL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415428-ACT

Das humane Gen **FRYL** kodiert ein großes zytoplasmatisches Protein, dem eine Rolle bei der Regulation der Zellmorphologie und der Organisation des Zytoskeletts zugeschrieben wird; berichtet wurden zudem Zusammenhänge mit Zellpolarität und aktinabhängigen Prozessen, die Migration und Gewebearchitektur formen. FRYL wurde mit Programmen der transkriptionellen Kontrolle und Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, die Wachstum und Differenzierung koordinieren, was auf Funktionen bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase während der Entwicklung und bei Stressantworten hindeutet. Veränderte FRYL-Expression oder Störungen seines regulatorischen Kontextes wurden in genomischen und transkriptomischen Studien zu Krebs und anderen komplexen Erkrankungen beobachtet, was die Untersuchung motiviert, wie FRYL Proliferation, Invasion und linien-/zelltypspezifische Genexpression beeinflusst. Als vergleichsweise wenig untersuchter Faktor bietet FRYL einen nützlichen Knotenpunkt zur Kartierung genregulatorischer Interaktionen und zytoskelettgekoppelter Signalwege in humanen Zellmodellen.

FRYL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FRYL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FRYL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FRYL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FRYL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FRYL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FRYL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FRYL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FRYL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FRYL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.