folliculin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403316-ACT

Das humane FLCN-Gen kodiert Folliculin, ein mit Tumorsuppression assoziiertes Protein, das als GTPase-aktivierendes Protein (GAP) für RagC/D wirkt und dazu beiträgt, die Aminosäure-Sensorik mit der mTORC1-Signalgebung an Lysosomen zu koppeln. Folliculin ist über Interaktionen mit FNIP1/2 und AMPK an der Energie- und Nährstoffhomöostase beteiligt und beeinflusst Autophagie, lysosomale Biogenese und den mitochondrialen Stoffwechsel. Eine Störung von FLCN beeinträchtigt Programme in Epithel- und Stromazellen, die mit Proliferation und Differenzierung verknüpft sind, und Keimbahnvarianten werden mit dem Birt–Hogg–Dubé-Syndrom in Verbindung gebracht, das durch renale und pulmonale Pathologie gekennzeichnet ist. Da Folliculin metabolische Signale und Stressantwort-Signalwege integriert, wird es breit in Signalwegen untersucht, die das zelluläre Wachstum und die Gewebehomöostase steuern.

folliculin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FLCN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

folliculin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FLCN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FLCN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen folliculin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FLCN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von folliculin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des folliculin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FLCN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.