Fnk CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404710-ACT

Humanes PLK3 kodiert die Serin/Threonin-Kinase Fnk, ein Mitglied der Polo-like-Kinase-Familie, das an stressresponsiver Signalübertragung und der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt ist. Die Aktivität von PLK3/Fnk wird mit der Regulation von Checkpoint-Signalwegen, DNA-Schadensantworten und apoptosebezogenen Signalwegen in Verbindung gebracht und integriert Signale aus oxidativem Stress und genotoxischen Einflüssen. Durch die Phosphorylierung nachgeschalteter Substrate beeinflusst PLK3 den mitotischen Verlauf und die zelluläre Homöostase und ist damit relevant für Studien zu Proliferation, Genomstabilität und Stressanpassung. Veränderte PLK3-Expression oder -Signalgebung wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, einschließlich krebsassoziierter Deregulierung von Zellzyklus- und Schadensantwort-Netzwerken.

Fnk Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLK3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fnk Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLK3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLK3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fnk-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLK3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fnk-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fnk-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLK3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.