Fibulin-5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402597-ACT

FBLN5 kodiert Fibulin-5, ein Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das an Elastin und Integrine bindet und so die Assemblierung elastischer Fasern sowie die Gewebeelastizität in Haut, Gefäßsystem und Lunge unterstützt. Fibulin-5 trägt zur Organisation der mikrofibrillären Architektur bei und moduliert die Zell–Matrix-Adhäsion. Dadurch beeinflusst es Prozesse wie das Verhalten glatter Muskelzellen, die Angiogenese und den Matrixumbau über Signalwege, die mit ECM–Rezeptor-Interaktionen und der Regulation von Proteasen verknüpft sind. Eine veränderte Expression oder Funktion von FBLN5 wurde mit einer dysregulierten Elastogenese, Bindegewebsfragilität und degenerativen Veränderungen in elastischen Geweben in Verbindung gebracht, was es zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der ECM-Homöostase macht. In humanen Modellsystemen wird die Perturbation von FBLN5 eingesetzt, um zu untersuchen, wie die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix zelluläre Signalwege, Biomechanik und Gewebephänotypen auf Gewebeebene prägt.

Fibulin-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FBLN5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fibulin-5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FBLN5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FBLN5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fibulin-5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FBLN5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fibulin-5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fibulin-5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FBLN5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.