Fibrillarin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400741-ACT

FBL kodiert Fibrillarin, eine essenzielle nukleoläre Methyltransferase, die innerhalb von Box‑C/D‑snoRNP‑Komplexen die 2′‑O‑Ribose‑Methylierung der prä‑rRNA katalysiert und so eine präzise rRNA‑Prozessierung sowie die Ribosomenbiogenese unterstützt. Durch seine Funktionen in der Organisation des Nukleolus und in der Koordination von RNA‑Modifikationen mit transkriptioneller und translationaler Leistungsfähigkeit trägt Fibrillarin zu grundlegenden Programmen der Proteostase und des Zellwachstums bei. Veränderte Nukleolusaktivität und eine dysregulierte Ribosomenproduktion – Prozesse, in denen FBL eine zentrale Komponente ist – stehen häufig mit onkogenem Stress und anderen Erkrankungen in Verbindung, die durch einen gestörten RNA‑Stoffwechsel gekennzeichnet sind. Als konservierter Knotenpunkt in RNA‑Prozessierungswegen wird FBL широко als Marker und mechanistischer Ansatzpunkt für die Untersuchung der Nukleolusfunktion und der Ribonukleoprotein‑Assemblierung genutzt.

Fibrillarin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FBL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Fibrillarin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FBL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FBL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Fibrillarin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FBL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Fibrillarin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Fibrillarin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FBL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.