FBL19 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407318-ACT

FBXL19 (FBL19) kodiert ein F-Box-Protein, das als Substraterkennungskomponente von SCF-(SKP1–CUL1–F-Box)-E3-Ubiquitinligase-Komplexen fungiert und spezifische Proteine dem ubiquitinabhängigen Abbau zuführt. Über die regulierte Proteostase trägt FBXL19 zur Kontrolle von Zellzustandsübergängen und Transkriptionsprogrammen bei; beschrieben sind zudem Funktionen in chromatinassoziierten Prozessen und in der signalabhängigen Genregulation. Als Teil der Signalwege des Ubiquitin-Proteasom-Systems kann eine veränderte FBXL19-Aktivität die Protein-Homöostase und nachgeschaltete Netzwerke stören, die Proliferation, Differenzierung und Stressantworten steuern. Eine Fehlregulation von Ubiquitinligasen, einschließlich F-Box-Proteinen, ist häufig mit Krebsbiologie und Entwicklungsphänotypen assoziiert, weshalb FBXL19 ein relevanter Ansatzpunkt für mechanistische Studien ist.

FBL19 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FBXL19-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FBL19 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FBXL19-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FBXL19-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FBL19-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FBXL19-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FBL19-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FBL19-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FBXL19-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.