Plasmide CRISPR d'Activation (m) FAM20C: sc-429814-ACT

Fam20c code FAM20C, une protéine kinase atypique sécrétée et résidente de l’appareil de Golgi, qui phosphoryle des protéines extracellulaires sur des motifs Ser-x-Glu/pSer, contribuant ainsi à façonner la composition et la fonction de la voie sécrétoire. Chez la souris, la phosphorylation médiée par FAM20C régule des protéines de la matrice extracellulaire, des facteurs de minéralisation et des composants de signalisation sécrétés, reliant le traitement golgien au développement et au maintien de l’homéostasie tissulaire. Cette activité recoupe les programmes d’ostéogenèse et de biomineralisation, et des altérations de la fonction de FAM20C ont été associées à des défauts d’organisation de la matrice squelettique et dentaire. En tant que régulateur des phosphoprotéomes sécrétés, FAM20C est pertinente pour les études sur le remodelage de la matrice, la communication cellule–matrice et les réseaux de signalisation dépendants de la sécrétion.

FAM20C Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Fam20c sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FAM20C Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Fam20c dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Fam20c, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FAM20C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Fam20c natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FAM20C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FAM20C dans les cellules tumorales présentant une expression de Fam20c silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.