FAM195A CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426985-ACT

Fam195a kodiert das Mausprotein FAM195A, einen bislang nur unzureichend charakterisierten Faktor, der auf Grundlage konservierter Domänenarchitektur und von Expressionsmustern zunehmend mit intrazellulärer Signalübertragung und stressresponsiven zellulären Programmen in Verbindung gebracht wird. Die verfügbaren Daten sprechen für Funktionen bei der Regulation der Protein-Homöostase sowie membranassoziierter Prozesse, die Zellwachstum, Differenzierung und die Anpassung an metabolische Signale beeinflussen können. Eine veränderte Aktivität von Signalwegen, die Proteostase und Stresssignale steuern, ist breit relevant für Phänotypen, die Gewebehomöostase sowie immunologische oder neuroentwicklungsbezogene Funktionen betreffen, wodurch Fam195a ein geeigneter Locus für mechanistische Studien ist. Da die funktionellen Annotationen weiterhin begrenzt sind, kann eine kontrollierte Modulation der endogenen Fam195a-Expression helfen, nachgeschaltete transkriptionelle Netzwerke und Abhängigkeiten von Signalwegen zu definieren.

FAM195A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Fam195a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FAM195A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Fam195a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Fam195a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FAM195A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Fam195a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FAM195A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FAM195A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Fam195a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.