FACE-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403350-ACT

Das humane Gen ZMPSTE24 kodiert FACE-1, eine Zink-Metalloprotease, die in die Membran des endoplasmatischen Retikulums eingebettet ist und zentrale proteolytische Schritte bei der Reifung von Prälamin A katalysiert. Durch die Abspaltung des farnesylierten C-Terminus von Prälamin A unterstützt FACE-1 die korrekte Assemblierung der Kernlamina, die Kernmorphologie und die Chromatinorganisation und verknüpft seine Aktivität damit mit Genomstabilität und Zellzyklusregulation. Eine Störung der ZMPSTE24-abhängigen Prozessierung begünstigt die Anreicherung toxischer Prälamin‑A‑Intermediäte und eine veränderte Mechanotransduktion, wodurch dieser Signalweg mit vorzeitigen Alterungsphänotypen und laminopathieassoziierten zellulären Stresszuständen in Verbindung steht. Die Funktion von FACE-1 ist zudem für die allgemeiner gefasste Proteostase der ER-Membran sowie für Netzwerke der Verarbeitung lipidmodifizierter Proteine relevant, die die Integrität der Kernhülle beeinflussen.

FACE-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZMPSTE24-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FACE-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZMPSTE24-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZMPSTE24-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FACE-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZMPSTE24-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FACE-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FACE-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZMPSTE24-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.