Enigma CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403254-ACT

Das humane PDLIM7 kodiert Enigma, ein PDZ‑LIM‑Domänen‑Adaptorprotein, das am Aktin-Zytoskelett sowie an fokalen Adhäsions-assoziierten Strukturen lokalisiert und Signalkomplexe mit zytoskelettalem Remodeling verknüpft. Enigma ist an Mechanotransduktion und Programmen der Zellmotilität beteiligt, indem es Protein‑Protein‑Interaktionen innerhalb von Adhäsions- und Stressfaser-Netzwerken koordiniert und dadurch Signalwege beeinflusst, die die zelluläre Architektur und Differenzierung steuern. Über seine Scaffold-Funktionen wurde PDLIM7 in Zusammenhängen der Organisation von Herz- und Skelettmuskulatur untersucht, in denen zytoskelettale Integrität und transkriptionelle Regulation eng gekoppelt sind. Eine dysregulierte Expression oder Lokalisation von PDLIM7 wurde in der Literatur mit veränderter Zellmigration und Phänotypen des Gewebe-Remodelings in Verbindung gebracht, die für kardiovaskuläre und onkogene Biologie relevant sind.

Enigma Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDLIM7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Enigma Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDLIM7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDLIM7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Enigma-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDLIM7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Enigma-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Enigma-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDLIM7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.