EN2/Engrailed 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403598-ACT

EN2 (Engrailed 2) kodiert einen Homeobox-Transkriptionsfaktor, der Genexpressionsprogramme reguliert, welche die Neuroentwicklung, die regionale Musterbildung und die neuronale Differenzierung steuern. EN2 beeinflusst den Chromatinzustand und transkriptionelle Netzwerke, die an Axonlenkung, synaptischer Organisation und der Reifung von Mittelhirn–Hinterhirn-Strukturen beteiligt sind, und ist in Entwicklungswege wie WNT/β-Catenin-, SHH- und FGF-Signalgebung eingebunden. Eine fehlregulierte EN2-Expression wurde mit einer veränderten Bildung neuronaler Schaltkreise in Verbindung gebracht und im Kontext neuroentwicklungsbezogener Phänotypen sowie der Biologie von Hirntumoren untersucht. Als ein mit Linienzugehörigkeit und Differenzierung verknüpfter Regulator ist EN2 ein nützlicher Knotenpunkt, um die transkriptionelle Kontrolle neuronaler Identität, Übergänge zwischen zellulären Zuständen und nachgeschaltete Zielgen-Netzwerke in humanen Modellsystemen zu untersuchen.

EN2/Engrailed 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EN2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EN2/Engrailed 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EN2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EN2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EN2/Engrailed 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EN2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EN2/Engrailed 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EN2/Engrailed 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EN2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.