Plasmide CRISPR d'Activation (h) Emt: sc-402628-ACT

L’ITK humain code la kinase des lymphocytes T inductible par l’IL‑2, une tyrosine kinase cytoplasmique (non réceptrice) de la famille Tec qui couple l’engagement du récepteur des cellules T (TCR) aux voies de signalisation en aval nécessaires à l’activation et à la différenciation des lymphocytes. ITK intervient dans les voies proximales du TCR qui convergent vers l’activation de PLCγ1, les flux calciques, la signalisation MAPK et des programmes transcriptionnels contrôlant la production de cytokines et les fonctions effectrices. Une activité d’ITK dérégulée est associée à un déséquilibre Th1/Th2, à une immunité antivirale altérée et à une lymphoprolifération anormale, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’homéostasie immunitaire et des mécanismes des maladies inflammatoires. Dans le contexte de la protéine Emt, ITK constitue un nœud exploitable pour disséquer la dynamique de la transduction du signal dans les cellules T humaines et des lignées hématopoïétiques apparentées.

Emt Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ITK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Emt Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ITK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ITK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Emt. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ITK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Emt au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Emt dans les cellules tumorales présentant une expression de ITK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.