Plasmide CRISPR d'Activation (h) Emi2: sc-405054-ACT

FBXO43 code pour la protéine humaine Emi2, un régulateur contenant un domaine F-box, surtout connu pour contrôler les transitions du cycle cellulaire en modulant l’activité de l’APC/C et, en aval, la dégradation de régulateurs mitotiques. En freinant la fonction du complexe promoteur de l’anaphase jusqu’à ce que les signaux appropriés du cycle cellulaire soient réunis, Emi2 contribue à une progression coordonnée à travers la phase M et au maintien de l’intégrité génomique. Une expression ou une régulation altérée des voies ubiquitine–protéasome du cycle cellulaire impliquant des protéines F-box est fréquemment associée à des phénotypes prolifératifs et à l’instabilité chromosomique observés en cancérologie. FBXO43/Emi2 constitue donc un point d’entrée mécanistique pour étudier la protéolyse médiée par l’ubiquitine, le contrôle des checkpoints et la prolifération dérégulée dans des modèles cellulaires humains.

Emi2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FBXO43 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Emi2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FBXO43 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FBXO43, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Emi2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FBXO43 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Emi2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Emi2 dans les cellules tumorales présentant une expression de FBXO43 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.