Plásmido CRISPR de Activación (h) eIF4AII: sc-402758-ACT

EIF4A2 codifica eIF4AII, una helicasa de ARN de tipo DEAD-box que actúa como componente central de la maquinaria de inicio de la traducción eIF4F. Al desenrollar estructuras secundarias en las UTR 5′ y coordinar la carga del ARNm en los ribosomas, eIF4AII favorece la traducción dependiente de cap y moldea la producción del proteoma en respuesta a señales celulares de crecimiento y estrés. Su actividad se vincula a vías que controlan la síntesis de proteínas, el metabolismo del ARN y la reprogramación traduccional adaptativa al estrés, procesos que con frecuencia se ven alterados en la biología de enfermedades asociadas a la proliferación y al estrés. La alteración del control traduccional mediado por miembros de la familia eIF4A se ha aprovechado para estudiar cómo la traducción desregulada de ARNm contribuye a la señalización oncogénica, la neurobiología y las interacciones virus–huésped, sin implicar un resultado clínico.

eIF4AII El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EIF4A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

eIF4AII El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EIF4A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EIF4A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de eIF4AII. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EIF4A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de eIF4AII en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía eIF4AII en células tumorales con expresión de EIF4A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.