Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF2C3: sc-401908-ACT

L’AGO3 humain (eIF2C3) code une protéine de la famille Argonaute, qui constitue un composant central du complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) et couple les petits ARN à une répression des transcrits cibles dépendante de la séquence. Par ses interactions avec les miARN et d’autres petits ARN, eIF2C3 contribue à la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique, façonnant les transitions d’état cellulaire, les réponses au stress et le contrôle, à l’échelle des réseaux, des programmes d’expression génique. Les voies dépendantes des Argonaute recoupent la régulation de la chromatine et la détection innée des acides nucléiques, influençant des voies impliquées dans la prolifération, la différenciation et l’homéostasie tissulaire. Une activité dérégulée des petits ARN/Argonaute a été associée à une altération de la régulation du transcriptome en cancérologie et dans d’autres maladies complexes où les réseaux de miARN sont perturbés.

eIF2C3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AGO3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF2C3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AGO3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AGO3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF2C3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AGO3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF2C3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF2C3 dans les cellules tumorales présentant une expression de AGO3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.