Plasmide CRISPR d'Activation (h) eIF2Bα: sc-404034-ACT

EIF2B1 code la sous-unité régulatrice eIF2Bα du facteur d’initiation de la traduction eucaryote 2B (eIF2B), un facteur d’échange de nucléotides guanyliques qui réactive eIF2 en catalysant l’échange du GDP contre du GTP. eIF2B intègre les signaux de la réponse intégrée au stress (ISR), reliant la phosphorylation d’eIF2α à une atténuation globale de la traduction et à la traduction sélective d’ARNm sensibles au stress lors du stress du réticulum endoplasmique, de la limitation en nutriments et des agressions virales. En contrôlant les taux d’initiation de la traduction, eIF2Bα influence la protéostasie, les décisions de survie cellulaire et l’adaptation métabolique. Une dérégulation de l’activité d’eIF2B est associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, notamment aux leucodystrophies liées à EIF2B, ce qui fait d’EIF2B1 un nœud d’intérêt pour l’étude de la signalisation du stress et du contrôle traductionnel dans les cellules humaines.

eIF2Bα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF2B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

eIF2Bα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF2B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF2B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de eIF2Bα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF2B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de eIF2Bα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie eIF2Bα dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF2B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.