Plasmide CRISPR d'Activation (h) EF-1 α2: sc-401444-ACT

EEF1A2 code le facteur humain d’élongation de la traduction EF‑1α2, une GTPase qui délivre les ARNt aminoacylés au site A du ribosome et contribue au maintien d’une synthèse protéique efficace et de haute fidélité. Au-delà de son rôle central dans la traduction, EF‑1α2 a été associé à l’organisation du cytosquelette et aux programmes de croissance cellulaire, via le couplage de la capacité de traduction à des réseaux de signalisation qui régissent la prolifération, l’adaptation au stress et la différenciation. Une expression ou une activité altérée d’EEF1A2 a été associée à une dérégulation de la protéostasie et au remodelage de l’état cellulaire observés dans de multiples contextes pathologiques, notamment des phénotypes neurodéveloppementaux et la transformation oncogénique. Par conséquent, EEF1A2 constitue un nœud utile pour étudier le contrôle translationnel, l’homéostasie du protéome et la manière dont des changements de l’équilibre des facteurs d’élongation remodèlent les phénotypes cellulaires.

EF-1 α2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EEF1A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

EF-1 α2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EEF1A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EEF1A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de EF-1 α2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EEF1A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de EF-1 α2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie EF-1 α2 dans les cellules tumorales présentant une expression de EEF1A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.