EED CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401234-ACT

EED (embryonale Ektodermentwicklung) kodiert eine zentrale Komponente des Polycomb-Repressionskomplexes 2 (PRC2), die an H3K27me3 bindet und die Methyltransferase-Aktivität von EZH2/EZH1 allosterisch stimuliert. Dadurch werden fakultatives Heterochromatin und eine stabile transkriptionelle Stilllegung verstärkt. Über eine PRC2-abhängige epigenetische Regulation trägt EED zur Festlegung von Zelllinien, zur Kontrolle des Zellzyklus und zur Aufrechterhaltung der zellulären Identität bei, indem es Chromatinkondensation und die Repression von Entwicklungsregulatoren koordiniert. Eine dysregulierte EED–PRC2-Funktion wird in verschiedenen Kontexten mit weitreichenden Veränderungen der H3K27-Methylierungslandschaften, aberranten Genexpressionsprogrammen sowie onkogenen oder entwicklungsbedingten Phänotypen in Verbindung gebracht. Entsprechend wird EED häufig in der Chromatinbiologie, in Differenzierungsmodellen und in Analysen auf Signalweg-Ebene zur Polycomb-vermittelten Genrepression untersucht.

EED Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EED-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EED Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EED-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EED-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EED-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EED-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EED-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EED-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EED-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.