EED Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401234-ACT

EED (embryonic ectoderm development) codifica una componente centrale del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2) che si lega a H3K27me3 e stimola allostericamente l’attività metiltransferasica di EZH2/EZH1, rafforzando l’eterocromatina facoltativa e il silenziamento trascrizionale stabile. Attraverso la regolazione epigenetica dipendente da PRC2, EED contribuisce alla specificazione di linea cellulare, al controllo del ciclo cellulare e al mantenimento dell’identità cellulare coordinando la compattazione della cromatina e la repressione dei regolatori dello sviluppo. Una funzione EED–PRC2 deregolata è associata ad alterazioni diffuse dei profili di metilazione di H3K27, a programmi di espressione genica aberranti e a fenotipi oncogenici o di sviluppo in molteplici contesti. Di conseguenza, EED è spesso oggetto di studio nella biologia della cromatina, nei modelli di differenziamento e nelle analisi a livello di via della repressione genica mediata da Polycomb.

EED Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EED senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EED Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EED nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EED, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EED. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EED nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EED nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EED nelle cellule tumorali con espressione di EED silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.