Dynamin II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401037-ACT

O DNM2 codifica a dinamina II humana, uma grande GTPase que catalisa a fissão de membranas durante a endocitose mediada por clatrina e outros eventos de tráfego vesicular. A dinamina II atua em coordenação com a remodelação de actina, proteínas com domínio BAR e complexos adaptadores para regular a internalização de recetores, a reciclagem de vesículas sinápticas e a triagem endossomal, moldando assim as respostas de sinalização e a homeostase da membrana. Por meio das suas funções na dinâmica de membranas, o DNM2 influencia processos como a citocinese e a distribuição de organelos, ligando o controlo endocítico à fisiologia celular mais ampla. Alterações na atividade ou na regulação de DNM2 estão associadas a fenótipos neuromusculares e do neurodesenvolvimento e são frequentemente investigadas pelo seu impacto no tráfego de recetores e na modulação de vias a jusante.

Dynamin II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DNM2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dynamin II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DNM2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DNM2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dynamin II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DNM2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dynamin II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dynamin II em células tumorais com expressão de DNM2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.