Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNAH3: sc-410012-ACT

DNAH3 code pour la chaîne lourde 3 de la dynéine axonémale, une ATPase dépendante des microtubules qui contribue à la motilité et à l’intégrité structurelle des cils et flagelles axonémaux. En tant qu’élément de la machinerie des bras de dynéine, DNAH3 participe à la génération et à la coordination du battement ciliaire au sein de la voie cilium/axonème, influençant l’écoulement des fluides et la signalisation mécanoréceptrice dans les tissus ciliés. Les perturbations des composants de la dynéine axonémale sont largement associées à des phénotypes liés aux ciliopathies, notamment des défauts de latéralité et l’infertilité masculine, et une altération de la fonction ciliaire peut interagir avec des programmes de signalisation du développement tels que Hedgehog. Ces caractéristiques font de DNAH3 une cible pertinente pour disséquer les processus dépendants des cils, la dynamique du cytosquelette et les relations génotype–phénotype dans des modèles de cellules humaines.

DNAH3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DNAH3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNAH3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DNAH3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DNAH3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNAH3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DNAH3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNAH3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNAH3 dans les cellules tumorales présentant une expression de DNAH3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.