Plásmido CRISPR de Activación (m) DEPTOR: sc-430194-ACT

Deptor codifica DEPTOR, un andamio con dominio DEP que se une a los complejos mTOR y los modula, influyendo en las salidas de señalización tanto de mTORC1 como de mTORC2. A través de su impacto en la detección de nutrientes, la síntesis proteica, la autofagia y la regulación del citoesqueleto, DEPTOR ayuda a ajustar el crecimiento celular y la adaptación metabólica. La alteración de la expresión de DEPTOR se ha vinculado con una actividad desregulada de la vía de mTOR en contextos como la biología del cáncer, la señalización de la insulina y la función de las células inmunitarias, lo que la convierte en un nodo útil para estudiar la retroalimentación de la vía y las respuestas al estrés. En modelos murinos, Deptor ofrece un punto de entrada manejable para investigar cómo la arquitectura de la red de mTOR determina la proliferación, la diferenciación y la homeostasis tisular.

DEPTOR El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Deptor sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DEPTOR El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Deptor en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Deptor, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DEPTOR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Deptor y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DEPTOR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DEPTOR en células tumorales con expresión de Deptor silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.