Plásmido CRISPR de Activación (m) DDB1: sc-419966-ACT

El DDB1 de ratón (proteína 1 de unión al ADN específica de daño) es un adaptador central del complejo ligasa E3 de ubiquitina CUL4–DDB1, que coordina la degradación dependiente de ubiquitina de proteínas reguladoras implicadas en el mantenimiento del genoma. Participa en la reparación por escisión de nucleótidos, el licenciamiento de la replicación del ADN, la remodelación de la cromatina y la progresión del ciclo celular mediante el ensamblaje de receptores de sustrato y la modulación de la proteostasis tras el estrés genotóxico. A través de estas vías, DDB1 influye en las respuestas al estrés replicativo y en programas transcripcionales vinculados a la proliferación y diferenciación celulares. La desregulación de la señalización de ubiquitina asociada a DDB1 y de los circuitos de reparación del ADN se estudia con frecuencia en modelos de inestabilidad genómica y biología relevante para el cáncer.

DDB1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ddb1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DDB1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ddb1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ddb1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DDB1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ddb1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DDB1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DDB1 en células tumorales con expresión de Ddb1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.