dCK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417715-ACT

Das humane DCK kodiert die Desoxycytidinkinase (dCK), ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym im Nukleosid‑Salvage‑Weg, das Desoxycytidin und verwandte Desoxynukleoside zu ihren Monophosphat‑Formen phosphoryliert und so ausgeglichene dNTP‑Pools für DNA‑Replikation und ‑Reparatur unterstützt. Die dCK‑Aktivität verknüpft den Nukleotidstoffwechsel mit dem Fortschreiten des Zellzyklus, Reaktionen auf Replikationsstress und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität, insbesondere in proliferativen Geweben. Eine dysregulierte DCK‑Expression oder ‑Aktivität wurde mit veränderter Nukleotidhomöostase und metabolischen Verwundbarkeiten in hämatologischen wie auch soliden Tumoren in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext zellulärer Differenzierung und Stressanpassung untersucht. Als zentraler Knotenpunkt des Nukleosidstoffwechsels eignet sich DCK zudem als Ziel, um Wechselwirkungen mit mitochondrialer Funktion, Redoxzustand und DNA‑Schadenssignalwegen zu untersuchen.

dCK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DCK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

dCK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DCK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DCK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen dCK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DCK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von dCK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des dCK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DCK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.