Plásmido CRISPR de Activación (h) Cytokeratin 12: sc-400955-ACT

KRT12 codifica la citoqueratina 12, una proteína de filamento intermedio tipo I que forma heteropolímeros obligatorios con queratinas tipo II para construir el citoesqueleto de queratina en el epitelio corneal diferenciado. Esta red de filamentos sostiene la integridad mecánica del epitelio, da forma a la arquitectura celular y coordina la estabilidad de las uniones y la remodelación del citoesqueleto durante los programas de estratificación y de diferenciación asociados a la reparación de heridas. La expresión de KRT12 está estrechamente ligada a la identidad de linaje del epitelio corneal y al estado de queratinización, y su desregulación se asocia con fragilidad del epitelio corneal y con fenotipos de distrofia corneal hereditaria. Como marcador estructural restringido a un linaje, la citoqueratina 12 se utiliza ampliamente para estudiar la diferenciación epitelial, las respuestas al estrés y la señalización dependiente del citoesqueleto que se integra con la adhesión celular y la homeostasis tisular.

Cytokeratin 12 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KRT12 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cytokeratin 12 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KRT12 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KRT12, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cytokeratin 12. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KRT12 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cytokeratin 12 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cytokeratin 12 en células tumorales con expresión de KRT12 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.