Plásmido CRISPR de Activación (h) cystatin B: sc-403769-ACT

CSTB codifica la cistatina B (estefina B), un inhibidor intracelular de proteasas de cisteína que limita la actividad de las catepsinas y ayuda a mantener la proteostasis durante el estrés lisosomal y el recambio de proteínas citoplasmáticas. Al amortiguar el daño mediado por proteasas, la cistatina B contribuye a la homeostasis de neuronas y células inmunitarias, influyendo en la susceptibilidad a la apoptosis, las respuestas al estrés oxidativo y la señalización inflamatoria. Las alteraciones en la expresión o la función de CSTB se han vinculado a fenotipos neurodegenerativos y neuroinflamatorios, por lo que es relevante para estudios del equilibrio proteasa–antiproteasa y la vulnerabilidad celular. CSTB también se utiliza como gen modelo para investigar cómo la regulación intracelular de proteasas afecta al procesamiento de antígenos y a las vías adaptativas frente al estrés.

cystatin B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CSTB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cystatin B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CSTB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CSTB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cystatin B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CSTB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cystatin B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cystatin B en células tumorales con expresión de CSTB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.