cyclin D1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400047-ACT

CCND1 kodiert Cyclin D1, einen zentralen Regulator des G1/S-Übergangs im Zellzyklus, der an CDK4/6 bindet und diese aktiviert, um die Phosphorylierung von RB-Familienproteinen zu fördern und dadurch E2F-gesteuerte Transkription freizusetzen. Durch die Integration mitogener Signale aus Signalwegen wie MAPK/ERK und PI3K/AKT koordiniert Cyclin D1 proliferative Reize mit dem Eintritt in den Zellzyklus und trägt zur Kontrolle der DNA-Replikation sowie von Checkpoint-Antworten bei. Eine fehlregulierte CCND1-Expression oder Amplifikation ist in zahlreichen Krebsarten häufig mit aberranter Proliferation und genomischer Instabilität assoziiert; veränderte Cyclin-D1-Aktivität wurde zudem mit Änderungen in Differenzierungsprogrammen und im zellulären Stoffwechsel in Verbindung gebracht. Als transkriptionell responsiver Knotenpunkt des Zellzyklus wird CCND1 in menschlichen Zellmodellen широко eingesetzt, um die Kopplung von Signalgebung und Proliferation sowie Abhängigkeiten von onkogenen Signalwegen zu untersuchen.

cyclin D1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCND1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cyclin D1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCND1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCND1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cyclin D1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCND1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cyclin D1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cyclin D1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCND1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.