Plasmide CRISPR d'Activation (h) CRY2: sc-403171-ACT

Le gène humain **CRY2** code la cryptochrome 2, une flavoprotéine sensible à la lumière bleue qui agit comme un répresseur central au sein de la boucle de rétroaction transcriptionnelle–translationnelle circadienne. CRY2 régule l’expression génique induite par CLOCK:BMAL1 en interagissant avec les protéines PER et en modulant le renouvellement dépendant de l’ubiquitine, façonnant ainsi les rythmes quotidiens du métabolisme, du timing du cycle cellulaire et de la signalisation hormonale. En se couplant à des réseaux de modifications post-traductionnelles, notamment la phosphorylation et la protéostasie médiée par des ligases E3, CRY2 influence des programmes transcriptionnels dans l’ensemble des tissus périphériques. Une activité ou une expression dérégulée de CRY2 a été associée à une altération de la régulation veille–sommeil et à un désalignement circadien lié à des phénotypes métaboliques et neuropsychiatriques, ce qui en fait un nœud utile pour des études centrées sur les voies.

CRY2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRY2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CRY2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRY2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRY2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CRY2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRY2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CRY2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CRY2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CRY2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.