CPS2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403519-ACT

Humanes CAD kodiert ein multifunktionales Enzym, das die Domäne der Carbamoylphosphat-Synthetase 2 (CPS2) enthält und die festgelegten, geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der de-novo-Pyrimidinbiosynthese katalysiert. Indem die CAD-Aktivität die Bildung von UTP und CTP unterstützt, verknüpft sie den Nukleotidstoffwechsel mit der DNA-/RNA-Synthese, dem Fortschreiten des Zellzyklus und Reaktionen auf Replikationsstress; die Regulation ist dabei über Wachstumsfaktor- und Nährstoffsensorik‑Signalwege wie mTORC1 und MAPK-abhängige Phosphorylierung koordiniert. Störungen des CAD-vermittelten Pyrimidinflusses können die Genomstabilität und Transkriptionsprogramme in schnell proliferierenden Zellen beeinflussen und machen CAD damit zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung der metabolischen Kontrolle von Proliferation und der Homöostase von Nukleinsäuren. Eine dysregulierte Pyrimidinbiosynthese und veränderte CAD-Expression wurden in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten beobachtet, darunter krebsassoziierte metabolische Umprogrammierung und erbliche neurometabolische Erkrankungen, was den Nutzen von CAD als zielgerichtetes, pfadbezogenes Forschungsziel unterstreicht.

CPS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CPS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CPS2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CPS2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CPS2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.