Plasmide CRISPR/Cas9 KO Coronin 2B (h): sc-407592

Présentation

CORO2B code la coronine 2B, une protéine se liant à l’actine qui s’associe au cytosquelette cortical pour réguler la dynamique des filaments d’actine, les ondulations membranaires (membrane ruffling) et les changements de forme cellulaire. Les protéines de la famille des coronines modulent le remodelage de l’actine via des interactions avec le complexe Arp2/3 et le renouvellement dépendant de la cofiline, reliant ainsi l’organisation du cytosquelette aux programmes d’adhésion et de motilité. Dans les cellules humaines, l’activité de CORO2B est pertinente pour des processus tels que la migration et l’invasion, fréquemment altérés dans le cancer et les microenvironnements inflammatoires. Les voies de remodelage de l’actine dérégulées impliquant les protéines coronines sont également étudiées dans le contexte de la morphologie neuronale et du remodelage tissulaire, où la plasticité du cytosquelette est essentielle.

Le Coronin 2B CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène CORO2B dans les lignées cellulaires human. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus CORO2B, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Coronin 2B plasmide HDR (h) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible CORO2B défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Coronin 2B CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert CORO2B.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus CORO2B et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons CORO2B essentiels à la fonction Coronin 2B
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.